小鼠細(xì)小病毒染料法熒光定量 PCR 試劑盒說(shuō)明書 【產(chǎn)品名稱】 商品名稱：小鼠細(xì)小病毒染料法熒光定量 PCR 試劑盒 【包裝規(guī)格】50 次/盒 【產(chǎn)品及特點(diǎn)】 本公司開發(fā)小鼠細(xì)小病毒染料法熒光定量 PCR 試劑盒，它具有下列 特點(diǎn)： 1.即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。 2.引物根據(jù)小鼠細(xì)小病毒專一區(qū)設(shè)計(jì)，特異性高。 3.熒光定量 PCR 檢測(cè)，比常規(guī) PCR 更加靈敏。 4.一管式閉管操作，降低了交叉污染。 5.本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。 6.本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷。 【規(guī)格及成分】 成分 編號(hào) 塑料盒包裝 2×qPCR MagicMix 90408 500 μL （棕色管） 熒光 PCR 專用模板稀釋液 180701 1 mL （黃蓋） 小鼠細(xì)小病毒染料法 qPCR 引物混 合液 4yw-8195 100 μL （白蓋） 小鼠細(xì)小病毒染料法 qPCR 陽(yáng)性對(duì) 照(1×10E8 拷貝/μL) 60908-81950 pc 50 μL （黃蓋） 使用手冊(cè) LZ4W-8195 1 份 【運(yùn)輸及保存】 低溫運(yùn)輸、 -20℃保存， 有效期一年。 【自備試劑】 DNA 模板、 超純水、 10×ROX （根據(jù)機(jī)型決定，具體見使用方法） 。 【使用方法】 一、 稀釋 PCR 陽(yáng)性對(duì)照 （以 10E2- 10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀 釋度為例） 1.注意： 由于陽(yáng)性對(duì)照濃度非常高， 因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的 區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分） 。 2.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7， 6， 5， 4， 3， 2。 3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯 槍頭，下同） 。 4.在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。 5.換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上 步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放 冰上待用。 6.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。 放冰上 待用。 7.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。 放冰上待用。 二、 樣品 DNA 的制備 8.如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制 備陽(yáng)性對(duì)照），一個(gè)是 NC （樣品制備陰性對(duì)照）。 可以用 10μL PCR 陽(yáng) 性對(duì)照的 10000 倍稀釋的 （稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL， 10μL 相當(dāng)于 10 萬(wàn)拷貝，可以將 10μL 原液加入到 990μL 自備 TE 溶液中， 充分混勻，此為 100 倍稀釋液。再取 10μL 此稀釋液加入到 990μL 自 備 TE 溶液中，充分混勻，此為 10000 倍稀釋液） 再加上一定量的水作 為制備的陽(yáng)性對(duì)照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所 用試劑盒的要求）?？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫?duì)照。制備所得成為樣品 DNA。 9.用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)核酸提 取試劑盒兼容。 三、 設(shè)置 qPCR 反應(yīng) （20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行） 10. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管， 其中 N+2 個(gè)用于上 步得到的 N+2 個(gè)樣品， 1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照， 6 個(gè) 用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè) PCR 管， 其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品， 1 個(gè)用于 PCR 陰 性對(duì)照（用水做模板）， 1 個(gè)用于 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（用 第 4 號(hào)陽(yáng)性對(duì)照 稀釋液， 濃度為 10E4 拷貝/μL） 。下面只描述定量分析的步驟，定性 分析只是把 6 個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個(gè)， 其余不變。 11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性 對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋 子儲(chǔ)存好后最后加） ： 成分 樣品管 N+2 個(gè) PCR 陰性 對(duì)照管 PCR 陽(yáng)性 對(duì)照管 （2-7 管） 2×qPCR MagicMix 10 μL 10 μL 各 10 μL 小鼠細(xì)小病毒染料法 qPCR 引物混 合液 2 μL 2 μL 各 2 μL 自備 10×ROX (見注) 2 μL 2 μL 各 2 μL N+2 待測(cè)樣品 cDNA 模板 6 μL - - 自備超純水 - 6 - 第 7 步所得 PCR 陽(yáng)性對(duì)照 稀釋 液（2-7 號(hào)） - - 各 6μL （2 號(hào)樣到 2 號(hào)管，3 號(hào)樣到 3 號(hào)管 …） 注:僅 ABI7500、 7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對(duì)照， 其他熒 光 PCR 儀 器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、 RotorGene3000、 RotorGene 6000 和 LightCycler480） 不需要使用 ROX， 則用水替代。 12. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR （具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀 器不同而自行優(yōu)化）。 過程 溫度 時(shí)間 預(yù)變性 95℃ 5 min PCR 反應(yīng) （40 個(gè)循環(huán)） 95℃ 15 sec 60℃ 1 min，（采集 SYBR 通道的熒光信號(hào)） 按儀器預(yù)設(shè)程序進(jìn)行熔解曲線分析 四、 數(shù)據(jù)處理 13. 如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)， 則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸， 以 Ct 值為縱軸， 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出 樣品 cDNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。 14. 如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須 大于或等于 35。 陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線， Ct 值應(yīng) 該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品， 如果其 Ct 大于或等于 35 則為陰性， 如 果小于或等于 30 則為 陽(yáng)性。如果在 30-35 之間，可結(jié)合熔解曲線判斷，若 樣品的熔解溫度與陽(yáng)性對(duì)照相同，該樣本判斷為陽(yáng)性，否則為陰性。 【關(guān)聯(lián)產(chǎn)品】 小鼠細(xì)小病毒探針法熒光定量 PCR 試劑盒
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